Fijación y Tinción (Morfología Macroscópica y Microscópica)

Preparaciones microscópicas: Fijación y Tinción
Antes de saber cómo fijar y teñir a las bacterias que aislamos, es necesario saber qué debemos observar al obtener el crecimiento bacteriano, y cómo identificar correctamente a los microorganismos que se nos presentan.

Morfología Macroscópica

Es la forma en que vemos a simple vista el crecimiento microbiano, sin necesidad de utilizar microscopio. Se basa en las características de crecimiento de las colonias.

• Hongos.- Los hongos por lo general, se ven macroscópicamente de colores opacos, de una estructura filamentosa (micelio) que se ve sedoso, seco, pueden formar colonias grandes.

• Levaduras- Forman colonias muy parecidas a las bacterias, solo que éstas son más cremosas, más grandes y por lo general crecen más en presencia de azúcares. Pueden presentar colores anaranjados, rosas, amarillos. El borde de estas, no tienen una forma o un borde tan definido como el de la mayoría de las bacterias.

• Bacterias.- Presentan colonias de diversos tamaños, bordes, elevaciones, colores, y consistencias o superficies. Estas características son de suma importancia para la identificación de la bacteria.

• FORMA: puntiforme, circular, rizoide, irregular, filamentosa. 
• TAMAÑO: grande (más de 3 mm.), mediana (2-3 mm.), pequeña (1-2 mm.)
• CROMOGÉNESIS: Reportar el color final después de la incubación (Blanquecinas, verdosas, rojizas, doradas, amarillas, etc.)
• ELEVACIÓN: plano, elevado, convexo, pulvinado 
• SUPERFICIE: suave, brillante, rugosa, plegada, seca, polvorienta 
• CONSISTENCIA: Blanda, mucosa, dura, etc. 
• BORDE: entero, ondulado, lobulado, filamentoso, ondeado 
• TRANSPARENCIA: transparente u opaca, con o sin brillo. 

Morfología Microscópica

• Hongos.- Los hongos filamentosos, tienen unas estructuras llamadas hifas, las cuales pueden estar segmentadas o n(2, segmentadas. Bajo el microscopio también tienen unas estructuras redondeadas, que son las esporas, las mismas que pueden permanecer en estado de latencia durante mucho tiempo y sobrevivir a altas temperaturas y a la desecación.

Clasificación micológica

• Levaduras.- Son estructuras más grandes que las bacterias, y también pueden formar cadenas, porque se dividen por gemación, pero se debe buscar la presencia de aseas (sacos) y las esporas que contienen. Se tiñen con azul de metileno para su mejor identificación. Es más fácil ver el proceso de gemación. -- 
• Bacterias.- Se dividen en cocos (esféricos), bacilos (cilíndricos), vibrios (en forma de coma), espirilos (son alargados y en espiral)

Las bacterias pueden tener presentar diversas estructuras como: pilis (pequeños pelos alrededor que ayudan a la fijación de la bacteria), flagelos (estructuras alargadas que le dan movilidad a la bacteria, pueden tener más de uno), cílios (estructuras que dan movimiento a la célula pero que no son tan largas como los flagelos). 

LOS COCOS SE PUEDEN CLASIFICAR SEGÚN SU AGRUPACIÓN EN

• Diplococos: células agrupadas de a pares. 
• Tetracocos: las células se agrupan de a 4 en un solo plano.
• Estreptococos: células agrupadas en cadenas cortas (2-6) y largas (10-20) debido a la división celular en plano vertical. 
• Estafilococos: las células se dividen en plano horizontal y vertical en forma simultánea originando una agrupación de células en forma de racimo. 
• Sarcina: la división celular ocurre en diversos planos produciéndose la formación de verdaderos cubos de células. 
• Micrococos: en la agrupación celular no existe un orden aparente o regular. Al realizar preparaciones que deban ser sometidas a tinción, se debe ser cuidadoso ya que esta agrupación suele desarticularse. 

 LOS BACILOS PUEDEN PRESENTARSE DE DIFERENTES FORMAS:
Sin agrupación. 

• Diplobacilos: células aisladas en parejas, ejemplo Klebsiella pneumoniae. Estreptobacilos: células bacilares en cadenas, ejemplo: Lactobacillus sp.
• Empalizada: disposición celular, una al lado de la otra, ejemplo: Corynebacterium diphteriae En grupos de a tres: semejando ramificaciones, ejemplo: Mycobacterium tuberculosis.

Concepto de fijación.- Se entiende por fijación toda manipulación sobre un ser vivo, o bien sobre parte de él, que tiene por objeto mantener toda su arquitectura tanto estructural como química lo más inalterada posible, de tal forma que sus componentes celulares mantengan las mismas características que cuando dicho ser o tejido estaban vivos. es claro que la mayoría de la estructura celular se debe a la presencia de proteínas y por tanto todo proceso de fijación debe tener en cuenta la naturaleza química de éstas, de forma que el fijador no reacciona con las mismas.

Concepto de tinción: es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las referencias a la morfología celular bacterian.

OBSERVACIÓN DE HONGOS

Una vez que veas crecimiento micelial (hongos), coloca en el centro del portaobjetos una gota de lactofenol, y extiende en su centro un trozo de micelio que contenga esporangios. Coloca el cubre objetos con cuidado y observa en el microscopio.

CLASIFICACIÓN DE ANIMITCÓTICOS

OBSERVACIÓN DE LEVADURAS

Puedes obtener un buen cultivo de levaduras, de las frutas dulces, como el mosto de la uva que dura algunas horas sin refrigeración y sin cubrirse, o también de las mermeladas.
Aquí hay un método para su obtención que podrías utilizar:

LEVADURAS DE MOSTO

• CULTIVO

1. Introduce as uvas en el cristalizador y, con ayuda del agitador, remuévelas sin romperlas. 5-10 minutos después echa el agua de lavar las uvas en el matraz Erlenmeyer, hasta un poco menos de la mitad.
2.Coloca las uvas en el mortero y exprímelas con ayuda del pistilo hasta que suelten todo el zumo. Filtra este zumo a través del embudo con papel de filtro para que vierta en el matraz Erlenmeyer. Agita el cultivo hasta lograr una suspensión homogénea.

• OBSERVACIÓN:

1. Coloca sobre un portaobjetos una gota de cultivo (o bien de mosto) y flamea la preparación hasta que la evaporación sea total. Sujeta el porta con los dedos. Estará bien flameado sin te quemas. Coloca la muestra sobre la placa Petri.

TINCIÓN DE GRAM

1.- Primero que nada tenemos que hacer una preparación de frotis.
Si la muestra está líquida.- Poner una pequeña gota de la suspensión bacteriana en un portaobjetos limpio y esperar a que se seque dentro del área de protección del mechero.
Si la muestra está sólida.- Poner una gota de solución salina 0.9% en el portaobjetos, luego con el asa de platino ya esterilizada y fría (pasada por el mechero), se toma la colonia a estudiar y se disuelve en el portaobjetos, con la solución salina, procurando que sea uniforme la suspensión. Dejar cerca del área de protección del mechero.
2.- Fijación
Una vez seco, se pasa 3 veces por el mechero, de manera rápida. Esta es la forma más fácil de fijación por calor. Recuerda que demasiado calor puede hacer que las bacterias se destruyan, y menos del calor necesario no permitirían la fijación de las mismas.

3.- Tinción de Gram

• Coloca unas gotas de cristal violeta, cuidando que cubra la superficie del frotis por 1 minuto
• Enjuaga suavemente con pizeta, sacude y agrega unas gotas de yodo lugol por 1 minuto.
• Enjuaga, sacude suavemente y agrega alcohol-acetona por 15 segundos. 
• Enjuaga, sacude suavemente y agrega safranina por 1 minuto. 
• Enjuaga, sacude suavemente y quita el exceso de agua con sumo cuidado. 

 Observa en el microscopio.