martes, 31 de julio de 2012

Fijación

FIJACIÓN
Introducción.- Antes de entrar en los detalles más significativos sobre los distintos métodos que existen para la fijación de tejidos vegetales, es necesario resaltar que los métodos más sencillos y más prácticos son los que no necesitan fijación, pero no siempre son posibles, ya que con frecuencia las muestras se encuentran alejadas del laboratorio, la capacidad de trabajo también es limitada y por tanto hay que recurrir a los métodos de fijación con mayor frecuencia de lo que sería deseable.
Examen en freco.- Este método tiene la ventaja de una gran simplicidad y por otra parte no produce alteración alguna en las muestras; en histología animal se presentan grandes inconvenientes para su uso, puesto que sólo pueden utilizarse, bien para organismos vivos de pequeño tamaño o bien para piezas sumergidas durante un tiempo limitado en líquidos fisiológicos (solución de Ringer, solución de Locke, solución de Tyrode, etc.). Los vegetales presentan ventajas sobre los animales, ya que se pueden fácilmente cultivar en el laboratorio o bien llevarlos desde le campo al mismo sin que los procesos de lisis se presenten con la rapidez que ocurren en los tejidos animales.
Aún teniendo estas ventajas sobre los tejidos animales, con mucha frecuencia debe recurrirse en histología vegetal al uso de fijadores, bine porque las muestras se recojan lejos del laboratorio durante campañas botánicas más o menos amplias o porque los trabajos se prolonguen excesivamente debido a largos tratamientos, por lo que es necesario recurrir a la fijación de las muestras a estudiar.
También queremos llamar la atención sobre las técnicas de fijación que se van a emplear y describir, ya que se refieren únicamente a técnicas para microscopía óptica, obviando las de microscopía electrónica, tanto de barrido como de transmisión.
Concepto de fijación.- Se entiende por fijación toda manipulación sobre un ser vivo, o bien sobre parte de él, que tiene por objeto mantener toda su arquitectura tanto estructural como química lo más inalterada posible, de tal forma que sus componentes celulares mantengan las mismas características que cuando dicho ser o tejido estaban vivos. es claro que la mayoría de la estructura celular se debe a la presencia de proteínas y por tanto todo proceso de fijación debe tener en cuenta la naturaleza química de éstas, de forma que el fijador no reacciona con las mismas. Es cierto que existen componentes muy distintos más o menos lábiles que también se encuentran formando parte de la estructura celular, pero son las proteínas las que nos van a reflejar fundamentalmente si un fijador es bueno o no bueno. Por otra parte, un fijador prepara también de alguna forma el tejido o la célula para la posterior manipulación, bien en el proceso de inclusión, actuando como mordiente o como fijador del colorante dependiendo de su naturaleza, por eso es importante la elección del fijador.
Hay razones por las que los tejidos vegetales no deben fijarse como los animales. Muchas veces las plantas están cubiertas de sustancias céreas en sus cutículas que son hidrófobas e impiden la penetración del fijador. Por otra parte el bajo contenido proteico de las células vegetales, en comparación con ls animales, vuelve al glutaraldehido (un componente de un fijador que se tratará más adelante), menos efectivo en sus enlaces curzados con la proteína. Así mismo la pared de las células vegetales supone una barrera parcial a la penetración del mismo.
Por otra parte hay que distinguir bien entre fijador y conservador, ya que con frecuencia, y sobre todo en histología vegetal, se tienen conceptos erróneos al respecto. Un conservador es aquella sustancia, o bien fenómeno físico, que evita la autolisis cadavérica, pero que una vez eliminada su accion, la muestra o la célula, quedan a merced de sus propios enzimas lisógenos y son por tanto susceptible de autodestrucción. son conservadores: frío, ciertos líquidos como los de Petit, de Ripert, etc. Así pues, una pieza que se ha mantenido durante un tiempo en un conservador debe ser fijada rápidamente antes de cualquier manipulación, ya que de no hacerse corre el peligro de que sufra graves alteraciones. un fijador por el contrario inmoviliza y estabiliza los elementos celulares, bien sea por precipitación de las proteínas y demás sustancias celulares activas, ya sea mediante un bloqueo químico de su actividad, siendo estos fenómenos permanentes.
En resumen, un fijador tiene como misión:
* Evitar la autolisis debida a los propios enzimas.
* Proteger el corte o la pieza del ataque bacteriano.
* Insolubilizar los componentes celulares que se desean estudiar.
* Preparar a las distintas estructuras para posteriores tratamientos.
* Evitar la disolución de determinados compuestos en el fijador.
* Conservar o provocar determinadas reacciones químicas.
* Mantener las propiedades físicas.

Para la elección de un fijador, hay que tener en cuenta, además de lo señalado anteriormente, unas características que son intrínsecas al mismo, como son la velocidad de penetración, la velocidad de fijación y el coeficiente de endurecimiento, así como el efecto de la retracción. Estos factores son de gran importancia a la hora de elegir un fijador; sobre todo, en histología vegetal. Es muy importante el coeficiente de endurecimiento y el efecto de retracción, ya que de por sí los tejidos vegetales son frecuentemente duros y estos dos fenómenos contribuyen a una mayor elasticidad de los tejidos, con el consiguiente posible perjuicio a la hora de manipularlos para obtener los cortes. Menor importancia tiene quizás el poder de penetración y la velocidad de fijación, ya que como se ha indicado anteriormente los procesos de lisis en los tejidos vegetales son más lentos en términos generales que en los tejidos animales; en cuanto a la velocidad de penetración y de fijación, son muy distintas, ya que un fijador puede tener una gran velocidad de fijación y un bajo poder o velocidad de penetración o viceversa. Por tanto la elección de un fijador es un problema de suma importancia en histología vegetal. un fijador ideal sería aquel que tuviera una gran velocidad de penetración y fijación y unos coeficientes de retracción y endurecimiento lo más bajos posibles.
Los fijadores que se usan para el tratamiento de los tejidos vegetales son prácticamente los mismos que se utilizan en histología animal; las células vegetales presenta, sobre todo en la pared celular, una estructura celulósica o bien una impregnación o sustitución de estas por compuestos distintos como la lignina, suberina, etc., que diferencia totalmente a los vegetales de los animales. El comportamiento de los fijadores, al menos a niveles muy distintos; si a ello le unimos que los estudios de los efectos sobre las estructuras celulares vegetales son prácticamente nulos, nos encontramos con un problema serio a la hora de elegir un fijador. En histología animal se saben que la mayoría de los efectos de retracción, endurecimiento, etc., que presentan cada uno de los fijadores utilizados, cosa que no se conocen cuando de tejidos vegetales se trata. Unicamente la experiencia y los ligeros conocimientos de química permiten al histólogo vegetal poder elegir un fijador que le ofrezca ciertas garantías; desgraciadamente, estos conocimientos no están reflejados en los textos de técnicas histológicas ni en los de histología vegetal. Por ello trataremos de ir incorporando a medida que avancen nuestros estudios y el acceso a la información las técnicas particulares de las que nos hagamos eco.
Vamos a dar un listado de los fijadores más frecuentes y a discutir bervemente sus distintas características. Los fijadores se pueden clasificar en dos grupos: fijadores físicos y fijadores químicos.
Fijadores físicos.- Son varios los fijadores físicos que usualmente se utilizan en histología, sobre todo por su simplicidad, pero la mayoría de ellos debemos desecharlos, porque alteran gravemente la estrucutra de los vegetales.
El calor: Es el más antiguo y más utilizado de estos fijadores. Tanto en microbiología, como en el frotis de células animales, la fijación se hace a la llama, con lo que se obtiene una coagulación rápida de las proteínas y por tanto su estabilización. Esta técnica no es recomendable cuando se trata de tejidos vegetales, puesto que produce alteraciones importantes y muy desiguales en las paredes celulares.
El frío: Como anteriormente hemos mencionado, el frío (congelación), se ha tenido y se tiene como agente de fijación, pero es realmente un agente conservador y por tanto no debe utilizarse como tal.
La criodesecación (liofilización): Se trata de congelar a una temperatura inferior a -50ºC y eliminar el agua a una presión baja. este método puede ser muy efectivo, si después la pieza se incluye en parafina o en plástico, pero es bastante complejo y excesivamente caro; no produce deformaciones ni retracciones, ni tampoco endurecimiento de las muestras. Su inconveniente es el precio y lo engorroso que puede resultar el que, al manipular la muestra, no se rehidrate posteriormente.

Fijadores químicos.- Existen numerosos fijadores químicos, unos simples, y otros que son mezcla de varias sustancias. los más reseñados en la bibliografía son: